干货!新型冠状病毒的检测方法及产品开发进展

干货!新型冠状病毒的检测方法及产品开发进展

日期:2020-2-2

【摘要】:新冠状病毒(2019-nCoV)检测目前只有荧光定量PCR方法和测序方法两种被认可的方法。测序不具备快速筛查潜力,这里不做讨论。目前国家药监局审批通过的都是荧光定量PCR的试剂盒。等温扩增的检测试剂盒,至少已有两个单位开发成功,有望近几天上市。等温扩增的试剂盒上市后,检测速度会大幅提升,检测过程只需要15分钟左右。基本可以满足当下疫情控制要求。

【说明】:鉴于当前技术进步非常快速,这里的信息随时可能会发生变化,请谨慎参考。

对抗当前的疫情,快速检测方法的可以快速确诊病人,快速隔离,快速采取措施。因此,各家科研机构以及相关的企业,特别是体外诊断企业、测序公司、大学、研究所以及疾控系统等,在这次新冠状病毒的检测产品开发中,扮演了重要的角色。中国科技大学罗昭峰简要介绍一下新冠状病毒的检测技术以及检测产品的开发情况。蕞后,也会给出个人的一点建议,希望对产品开发,以及基金申请选题有所帮助。

一、新冠状病毒相关检测技术

世界卫生组织及国家推荐的检测方法是检测病毒的基因,通过荧光定量RT-qPCR的方法或者是基因测序的方法(1)。其它的方法很难达到实际检测所要求的灵敏度,这里基本不予考虑。测序方法由于比较慢,价格也比较昂贵,适合从事研究但不适合作为筛查手段。检测核酸的方法中,由于这次的新冠状病毒是RNA病毒,所以需要加入一步反转录的过程,再进行PCR扩增。目前的检测方法有荧光定量PCR方法和等温扩增的方法,还有数字PCR技术以及基于试纸检测的方法。还有一些研究的目标是加快样品前处理,提升检测通量,提升检测自动化水平,以及降低对设备的要求,对检测人员的要求和降低成本。目前试剂盒检测的标本主要是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血清及血浆等。

1、 常规荧光定量PCR方法。目前上市的试剂盒都是基于核酸检测的。蕞早上市的华大基因的方法,采用单基因检测,前后大约需要3小时。后来,有些公司的产品有了一些改进,如多基因检测,或者使用适合快速扩增的酶,都在一定程度上可以提升检测速度。2020年1月28日,第二批获得药监局批准的试剂盒中,圣湘生物采用了独创的RNA一步法技术,灵敏度为200copies/mL,样本处理与扩增检测在一个PCR反应管中即可完成,zui大程度减少生物安全风险和交叉污染,可以在30分钟给出结果,这应该是这种方法的极限。而且应该没计算样品处理的时间(2)。

2、 等温扩增法:从原理上讲,等温扩增是较快且灵敏的方法。该方法也是检测病毒的核酸,只是信号放大的策略不同,只需要一个温度就可以了,不需要像常规PCR那样,需要在2~3个不同的温度之间进行循环。等温扩增减少了升降温,反应时间要比常规的PCR快很多,只需要十几分钟。但是,基于这种技术的试剂盒开发要比常规Q-PCR试剂盒复杂一些,涉及多对引物,所以截至今天还没有正式上市的产品。但至少有两个团队已经完成产品开发。

3、 试纸条法(胶体金免疫层析法):该方法快速方便,优点适合快速筛选,便宜,不依赖仪器。在病毒浓度低的时候,会导致漏检,获得国家药监局批准的可能性较小。

4、 样品前处理及检测自动化:除了在检测环节提升检测效率之外,缩短样品前处理时间,提升检测通量,提升检测自动化也是一个重要研究方向。

5、 辅助技术开发:如开发能降低检测对环境要求的仪器或试剂。这次所有的检测都必须在P2(二级生物安全实验室)进行。这是一大限制因素,这种实验室建设周期长,审批慢。不可能短时间建成,只能利用现有资源。这也是湖北省每天检测能力受限的重要原因。因此,开发不依赖于P2实验室的检测试剂和方法,也是当前的一个重要方向。

二、相关产品介绍

1、 荧光定量PCR检测试剂盒,目前共有6家公司的产品获得国家药监局审批通过。

从1月10日公布新冠状病毒的基因序列,到今天为止恰好经历了三周。这三周也是疫情快速发展变化的三周,也是各相关科研人员与时间赛跑的三周。已经有6家获得国家药监局的批准上市。

1月26日,国家药监局仅用4天时间应急审批通过上海之江生物、上海捷诺生物、华大基因、华大智造4家企业的4个新型冠状病毒检测试剂,创造了中国审评审批速度1月28日,批准获批的2个企业分别是达安基因和圣湘生物。至此,已有6家企业的产品正式获批。还有多家企业等待审批,如辉睿生物、伯杰医疗等近20家企业。有些企业直接选择在省内审批,在省内使用的方法。后面详细附上相关公司及产品介绍。

 2、 等温扩增检测试剂盒 尚未获批

1月27日,徐涛院士团队告诉记者,他们开发的等温扩增试剂盒可以在30min内给出结果。目前未见进一步报告(3)。

1月29日,中国疾病预防中心病毒病预防控制所联合奇天基因成功研制新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸等温扩增快速检测试剂盒,可在8-15分钟内出结果(4)。

3、 试纸条法:

1月29日, SBC生物芯片上海国家工程研究中心旗下上海芯超生物科技有限公司宣布,其已成功研制出了新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测试剂盒(胶体金免疫层析法),加样后15分钟内就可以观察结果。该技术产品将可方便快速地用于社区卫生服务中心、基层医院的早筛早诊,不但增加检测和诊疗的时效性,而且可以有效防止广大群众在大型医院密集检查而导致的交叉感染(5)。

同一天,绍兴同创医疗器械有限公司宣布研制出可以快速筛查冠状病毒的筛查检测试纸(胶体金法),该试纸可十分钟出结果(6)。

热景生物也在不久前推出新型冠状病毒IgM抗体检测试剂(胶体金免疫层析法),具有敏感性高、诊断时间早等优点(26)。

4、 数字PCR法:绍兴同创医疗器械有限公司与李兰娟院士的感染性疾病诊治协同创新中心开发出三款产品,其中之一就是基于数字PCR方法(7)。依据个人对数字PCR技术的了解,该技术对于临床检测的意义不大。通量低,价格高,速度慢,仪器少。

永诺医疗研发团队针对新型冠状病毒开发了数字PCR检测试剂盒。该试剂盒采用创新的一步法逆转录数字PCR技术,将 2019-nCoV的RNA逆转录及数字PCR扩增整合到一个反应体系,单管双检同时测定2019-nCoV两个独立基因,消除由于病毒变异带来的漏检风险(21)。

锐讯推出的病毒检测试剂盒也是市面上唯一一款兼容数字PCR仪和荧光PCR仪的试剂盒,大大降低了用户应用门槛。同时从技术原理上来说,数字PCR的检测灵敏度较荧光定量PCR高1-2个数量级,更适合检测微量痕量病毒,此次冠状病毒感染也出现了早期症状不明显,但是核酸检测呈阳性的的“潜在感染者”和“隐藏患者”(22)。

1月28日的报道,新羿生物在国家CDC的指导下与清华大学生物医学工程系等单位协力合作,正在开发数字PCR法2019-nCoV核酸检测试剂盒(23)。

 三、其它尚未批准的产品

1、 绍兴同创医疗器械有限公司与李兰娟院士的感染性疾病诊治协同创新中心,迅速成功研制了三类冠状病毒检测系列产品,分别为: 新型冠状病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法,免提取,45分钟快速检测)、新型冠状病毒核酸低拷贝检测试剂盒(数字PCR法,2小时常规检测)、 用于初期筛查的检测试纸(胶体金法,10分钟快速检测)(8)。

2、 山东艾克韦生物技术有限公司开发的试剂盒:1月26日下午,山东省药监局接到山东艾克韦生物技术有限公司研发的2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒,省器械检验中心立即组织检验,并于27日上午9点完成所有项目检验,产品符合技术要求,成为山东省法定检验机构检定合格的首个新型k状病毒检测产品(9)。

3、 中拓生物有限公司开发的系列产品 2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒(多重荧光PCR法)、2019新型冠状病毒(N基因)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、2019新型冠状病毒(ORF1ab基因)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)三种试剂盒均已成功通过国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量管理监督检验中心的注册检验,产品将用于新型冠状病毒的鉴别诊断,为疾病防控贡献力量(10)。

4、 江苏硕世生物股份有限公司开发的试剂盒。1月10日新型冠状病毒正式公布后,江苏硕世生物股份有限公司仅耗时3天,就完成了对新型冠状病毒核酸检测试剂盒的开发与生产,并快速向全国各省市提供诊断试剂与服务(11)。

5、 广州多家机构开发出了诊断试剂盒产品。包括达安基因、万孚倍特、华银医药、和信健康、微远基因等企业研发出新型冠状病毒检测试剂盒后,广纳信捷医疗(以下简称“广纳信捷”)与中科院国家纳米科学中心联合攻关的新型冠状病毒等温快速检测试剂盒研发接近完成,各项指标均满足临床应用要求,蕞快可实现30分钟出检测结果(12)。

6、 苏州海苗生物科技有限公司研发的超敏2019-nCov检测试剂盒于1月25日下线,该试剂盒可以快速检测人传人的二代、三代、四代新型冠状病毒。它的成功研发,可为新型冠状病毒感染肺炎的确诊起到重要作(13)。

7、 世和基因生物技术有限公司研发的新型冠状病毒检测试剂盒于1月27日推出,并正在申请进入国家药监局为此次疫情开辟的应急审批通道(14)。

8、 厦门大学专家团队与致善公司联合研制的新型冠状病毒(2019-nCoV)现场检测一体机已完成内部测试,即将开展临床评估。该型仪器可用于新型冠状病毒的现场检测,无需严格实验室条件,无需专门培训,仅需一步加样,仪器便可自动完成检测并出具报告(15)。

9、 奥然生物全自动qPCR一体机,助力新型冠状病毒的精准快速检测(16)。

10、 成都高新区企业迈克生物与1月29日成功研发出西南首个新型冠状病毒检测试剂盒,将为西部地区乃至全国有效筛查和防控新型冠状病毒提供有力保障(17)。

11、 陕西佰美医学检验实验室开发的检测试剂盒,已于1月27日,向西安市临检中心报备,服务社会(18)。

12、 广东凯普生物科技股份有限公司于1月29日完成两款新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒产品研制工作(19)。

13、 福州大学生物科学与工程学院自主研发出新型冠状病毒检测试剂盒,并与泰普生物科学(中国)有限公司合作,迅速实现产学研转化(20)。

14、据体外诊断网报道,新冠病毒检测试剂可先用后申报,1月28日,已有81家企业已可提供(21)。

15.迅敏康1月21日迅敏康就已完成了“2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”及配套IngeniFast®?迅敏全自动PCR前处理系统的研发,并于(1月26日)正式推出(25)。

 三、小结

1月30日晚,湖北省委书记蒋超良在新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控工作新闻发布会上表示,湖北省共有28家医院能够做样本检测,单日的样本检测能力已提高到约4000份。可见,检测试剂和检测能力短缺的情况有所缓解。

如果现在才开始开发RT-qPCR检测试剂盒,需要仔细权衡一下。因为现在太多家企业在做相关产品,乐观估计,等几天之后开发完成,再等获得认证通过,估计疫情差不多结束了。早期大量企业一起研究,一起竞争,提升效率,我认为是很有必要的。但在今天,近二十家产品已经上市的情况下,潜在产能也许远远超出实际需求的情况下,再投入精力,研发重复性的检测试剂盒,未免有些浪费。

但是,如果检测方法有革命性的改进,依然值得探索。譬如能做到“省时、省钱”,在检测时间上能够大大缩短,在检测步骤上更为简单,对环境对仪器对人员的要求更低;检测成本更低;更加方便,更加安全,更加准确等等,这样的话还是值得继续去探索的。

我觉得当前的研究方向,可以转向治疗,以及更基础的研究方向。比如防控,治疗,以及致病机理研究等方面。

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