润扬仪器一问一答 | 液相色谱柱使用过程中常见问题

润扬仪器一问一答 | 液相色谱柱使用过程中常见问题

日期:2020-8-19

液相色谱柱在色谱分析系统中主要起着分离检测物质的作用,如同色谱系统的心脏,同时也是易损耗品。为了减少损耗,色谱柱的使用维护至关重要!

液相色谱柱使用过程中蕞常见的问题包括pH值、温度、溶剂耐受、压力、样品等。色谱柱使用条件不得超出厂家建议的范围,包括高压力,pH范围,水相耐受,柱温等。当测试条件接近色谱柱使用范围的极限值时,柱寿命会受影响。

1、C18柱子如何调PH和温度以提高分离度呢?

答:通过调整pH和柱温优化分离度,这是方法开发中非常重要的手段。简单来讲,中性或不可电离化合物对pH变化不敏感。对于可电离化合物而言,可以通过调整流动相pH值,控制化合物电离状态来改变化合物的反相保留。降低pH可增大酸性化合物保留,而提高pH则可增加碱性化合物保留。通过调整pH改变化合物保留进而优化各个组分之间的分离度。通常提高柱温使得传质加快,保留也会降低,但是不同化合物保留对温度变化敏感程度不同,因此也可以通过调整柱温改变各个组分的保留时间来优化分离度。

2、色谱柱总超压可能是什么原因呢?

答:超压一般是液相流路内部包括色谱柱在内可能有堵塞。需要先做分段排查确定堵塞的部位,再根据堵塞部位排查引起堵塞的可能原因。如果是色谱柱堵塞,比较常见的原因有很多,如样品脏、基质复杂并且没有经过良好的预处理,或者预处理之后进入液相系统后又析出从而造成堵塞或污染(解决方法:加强样品预处理);色谱柱超压或超出pH范围使用导致填料碎裂,碎屑颗粒堵塞色谱柱(解决方法:根据测试条件选择合适色谱柱,避免超范围使用);仪器使用过程中部件磨损碎屑造成的堵塞(解决方法:及时更换受损部件)等等,都会引起系统色谱柱压力升高。

3、C18柱子出峰时间拖后是什么因素影响?

用一段时间出峰时间就拖后了,请问与流动相有没有关系?答:液相色谱中影响化合物保留的主要因素包括:样品,色谱柱,流动相(流速,组成,比例等),柱温等。使用过程中发现保留时间漂移的话,需要从以下几个影响因素进行排查:可以先通过对比保留时间漂移前后相同条件下的压力曲线是否重现,从而初步排查可能的原因。若压力曲线不重现,首先确认测试条件是否有改动,检查流动相流速,组成,比例等是否改变,是否存在漏液或进气泡引起的流速和比例变化;对流动相组成变化敏感的样品和方法,应确保每次配制流动相的重现性;检查色谱柱是否堵塞污染;仪器控温是否准确等等,可能的原因比较多,具体原因需要进一步排查。

4、色谱柱用什么流动相保存蕞好?用纯有机试剂是否容易干?

答:反相柱可以用HPLC级的甲醇或者乙腈保存,注意紧密连接堵头。正常情况下只要堵好堵头,溶剂是不容易干的。当然在保存溶剂中添加5%-10%的水,也没有问题。

5、乙腈流动相总是容易聚合,有没有什么解决办法?

答:乙腈的聚合需要一定条件和时间,务必使用品质可靠的HPLC级溶剂,并且保证所使用溶剂尽可能新鲜。如果是放置保存比较久的乙腈溶剂,使用之前先过滤一下再用会有一定改善。

6、小分子极性物质一般选用什么液相色谱柱?

答:可以先尝试用能够耐受高比例水相的柱子,提高流动相水相比例来增强保留。如果是可电离化合物,如酸性或者碱性化合物,可以在反相模式下先尝试通过调整流动相pH增大保留,酸性化合物需降低流动相pH,碱性化合物则提高流动相pH,根据pH条件选择可以耐受的色谱柱。如果调整pH后反相模式保留仍然很弱,您还可以考虑使用其他保留模式的色谱柱,例如HILIC柱,HILIC-Z,HILIC-OH5,或者纯硅胶的HILIC柱等等,也可以使用离子交换色谱柱或者正相色谱等。

7、柱子分离效果差了该怎么处理?

答:导致色谱柱分离度降低的原因,主要是色谱柱柱效下降及色谱柱选择性发生改变。引起柱效下降的原因比较多,如果是连接不当造成的柱效损失,重新正确连接即可。如果是色谱柱使用中由于柱子污染引起的柱效下降或选择性改变导致的分离度降低,可以尝试对柱子进行清洗再生。如果是色谱柱本身的损伤引起的柱效下降分离度变化,这种通常是不可逆的,只能更换色谱柱,并且在后续使用新色谱柱的时候尽量避免各种损伤柱子的操作。

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