润扬仪器相关色谱技术人员近期参加由仪器信息网主办，我要测网、仪课通联合协办的《气相色谱实战宝典》、《液相色谱实战宝典》线上交流会。本次线上交流会邀请《气相色谱实战宝典》特邀顾问、北京化工大学教授杜振霞，《气相色谱实战宝典》主编、广东省生物制品与药物研究所主任技师徐明全及鹤壁市农产品质量安全监测检验中心高级农艺师张艳丽；《液相色谱实战宝典》特邀顾问、中国科学院兰州化学物理研究所研究员邱洪灯，《液相色谱实战宝典》主编、徐州市畜禽水产品质量检测中心质量负责人端礼钦，《液相色谱实战宝典》副主编、江苏国测检测技术有限公司技术负责人王韦岗进行答疑，旨在帮助一线用户解决学习或工作中遇到的实际问题。
整场交流会气氛十分热烈，6位专家同时在线答疑，网友们踊跃提问，共收集问题60余个。上期润扬仪器整理了“实战宝典一气相色谱仪答疑集锦”部分问答，供大家参考。本期特整理“实战宝典二液相色谱仪答疑集锦”部分问题。
《液相色谱实战宝典》答疑集锦
问题一：老师，pfp色谱柱能替代C18色谱柱吗？
邱洪灯答：ACE C18-PFP相显示有PFP相的多重保留机制，包括疏水性、π-π相互作用、偶极-偶极、氢键和形状选择性。还具有刚性结构，在一定程度上具有更好的选择性，有时候可以用来代替常规C18色谱柱。
问题二：邱老师，我在做九种色素方法开发的时候，有两个峰分不开，几乎完全重合，老师有没有遇到类似情况，流动相仪器条件什么的，都是按照国标进行的。
邱洪灯答：是不是可以更换不同厂家的色谱柱？如果可以的话，可以考虑更换选择性更高的柱子。
问题三：邱老师，色谱方法开发过程中需要注意什么问题？
邱洪灯答：宝典里有答案，各个实验条件都要考虑到：固定相、流动相（有机溶剂比例、缓冲溶液）、流速、柱温等等一系列……
问题四：邱老师可以分享下手性化合物分离的一些经验技巧吗？
邱洪灯答：还是要选择好手性色谱柱和流动相，正相和反相都可以试试，SFC也是很好的一种分离方法。
问题五：如何根据化合物的特性选择合适的键合相？如何对色谱柱进行维护与保养?
端礼钦答：
关于色谱柱的维护与保养，可参考《液相色谱实战宝典》第94页。未领取的网友可点击文末链接一键领取。
问题六：面积归一法测有关物质中，如何做方法验证？
端礼钦答：参考中国药典9101通则，看你有关物质是做定量还是限度，如果是做定量，就要做专属性、线性、精密度、准确度、范围、定量限等要求；如果是做限度，就只要做专属性、检测限、耐用性。
检验检测实验室所述的方法验证，是在RT/T 214-2017通用要求的4.5.14中，指的是需要识别相应的人员、设施、环境、设备等技术能力能否满足要求，还应通过试验证明结果的准确性和可靠性。具体要求可参考：
GB∕T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南
GB∕T32465-2015 化学分析方法验证确认和内部质量控制要求
问题七：端老师，您好！待测物Pka值在液相色谱分析方法开发如何运用，怎么简单快速查Pka值。
端礼钦答：pKa：酸式解离常数Ka的负对数，即 ： 
pKa越小，酸性越强；反之，酸性越弱。
对于酸性和碱性分析物，其保留因子和流动相pH的关系图为：
酸性条件（低pH值）有利于酸性分析物的保留，而碱性条件有利于碱性分析物的保留。且在pH大于或者小于某个值时，保留因子不随pH的变化而变化，而在这两个阶段中间，保留取决于离子化程度。
文献中缓冲盐的pH和pKa以及分析物的pKa数据很多是在水中测定，但是pH和pKa都会随着有机溶剂的加入而发生改变。一般来说随着有机溶剂的加入，酸的pKa变大，而碱的pKa变小。虽然有这些变化，缓冲液的缓冲能力并不会因为有机溶剂的加入而发生变化。因此在配置缓冲液的时候，强烈建议在加入有机溶剂之前调节pH值至目标值，当加入有溶剂后，溶液pH会发生变化，但是此时无需再调节。另外，为防止混合过程中缓冲盐发生析出，务必将有机相加入水相，而不是将水相加入有机相。
如何快速查Pka值
第一，对于已知化合物，我们可以通过一些数据库进行查询。在这里比较推荐几个开放的数据库，第一个是英国RSC的www.chemspider.com，这是一个通用型的数据库，收录的化合物类型也比较广；第二个是针对于药物分子数据的加拿大数据库www.drugbank.ca，第三个是基于美国国立卫生研究院开放化学数据库的https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，只要输入目标化合物的CAS号或者英文名，就很可能可以在这几个数据库上查到相关信息。
第二，假如我们没办法在数据库中查到相关信息，我们可以根据一些已知数据进行预测。对于一些典型的化学物，我们应该熟知它们的pKa。常见的脂肪族羧酸pKa值约为5，比如布洛芬的pKa为5.2；典型的胺类化合物的pKa约为9，比如阿米替林的pKa是9.4。这样在分析一些酸碱性的问题时就可以信手拈来，方便快捷。如果要尽量准确地预测一个新化合物的pKa，这就是一个比较系统的工程，因为一般一个化合物的pKa除了与它的关键基团如羧基、氨基等有关，还和这些基团所连接的其他结构有关，因此蕞好以结构尽量类似的已知化合物的pKa为基础进行预测。
问题八：示差检测器走样品时基线突然上移，是什么原因啊，其它没影响（参比池肯定冲好了，检测器温度也没有变化），紫外检测器可能是电信号，示差检测器工程师也没遇见过，想请教一下可能原因？
王韦岗答：首先，得区分一下基线上移的形式；如果基线是缓慢的向上漂移，影响的因素可能有流动相、色谱柱、流通池或者参比池、仪器性能（如单向阀、泵的稳定性等）、温度、平衡时间等等；
如果走样品时基线突然上移，不走样品时基线没有异常，可以初步判定基线的上移与样品有关联，这时要考虑溶解样品的溶剂、样品与溶剂的互溶性等。
另外一种形式是基线突然向上或向下阶梯式漂移，这种情况，需要检查一下压力波动是否异常，是否有规律性。如果压力异常，则通常与单向阀或泵有关。
另外，示差检测器的信号输出也是光电转换的过程，电压或检测器的异常也可能产生基线的阶梯式变化。
问题九：示差检测器基线波动大，果糖、葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖，检出限响应几乎就是基线，流动相是同一个瓶子里的乙腈水。
王韦岗答：（1）示差检测器灵敏度低，如果做样时基线波动大，会影响样品的测定，因此，首先需要解决基线波动大的问题。前面一个问题解答中提到，示差检测器受流动相组成的影响很大，因此不适合梯度洗脱，即使是使用单通道进行检测，仪器单向阀或者泵的稳定性同样会影响基线，另外流动相的混合也会导致基线有异常。
（2）果糖、葡萄糖、蔗糖、三氯蔗糖，检出限响应几乎就是基线，首先基线波动大，检出限就会高，因为检出限是与基线噪音相关的；另外，示差检测器受温度和平衡时间影响很大，在解决完基线噪音问题之后，同样是建议做样前可以提前一天打开仪器进行预热，如果仪器没有完全预热稳定，示差检测器可能会出现进样不出峰的情况，这种情况我们也遇到过。
（3）果糖、葡萄糖、蔗糖用示差检测器检测响应值还是可以的，示差检测器虽然也可以用于三氯蔗糖的测定，但是响应值较小，建议有条件的老师可以用蒸发光检测器进行检测。
（4）《液相色谱实战宝典》第二章第五节中介绍了示差检测器以及解决示差检测器基线漂移的方法。
问题十：一种新的化合物需要测纯度时怎样快速合理的找到高效液(紫外检测器)相适用的检测方法。
王韦岗答：《液相色谱实战宝典》里第五章中也较为详细的介绍了液相色谱方法开发的步骤和注意事项，大家可以关注一下。这里我就简单的给大家介绍一下方法：首先，得了解新的化合物的性质或者结构，看该化合物是否适合用液相色谱进行分析，如果要用到紫外检测器，还需要看该物质是否具有紫外吸收，没有紫外吸收，肯定不能用紫外检测器进行检测了；如果确定新的化合物具有紫外吸收，能用液相色谱方法进行测定，下一步就是建立高效液相色谱的分析方法，这时候我们可以去查阅一下标准、药典以及期刊论文，如果能在文献中找到合适的方法，则会事半功倍，直接重复别人的方法，能够节约许多方法开发的时间；如果没有相同的物质，可以尝试寻找一些结构类似物质的高效液相色谱分析方法，如果上述方法都行不通，只能从基础的开始，从新化合物的性质开始分析，然后选择合适的流动相、色谱柱、甚至是更换检测器。
